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Avances en la
cuantificación del inóculo de Verticillium dahliae en suelo
mediante el uso de técnicas moleculares
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Clemente, G., Laich, F., Quiroz, F., Escande, A.
UIB (FCA, UNMdP - EEA INTA Balcarce), C.C. 276, (7620) Balcarce.
Gclemente@balcarce.inta.gov.ar |
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INTRODUCCIÓN
La marchitez de girasol causada por
V. dahliae es una enfermedad monocíclica, por ello es
importante cuantificar el inóculo primario que está en el suelo (microesclerocios).
Para ello se dispone de metodologías de recuento de colonias de
V. dahliae en medios de cultivo semiselectivos,
pero estos métodos brindan resultados variables y son laboriosos al
momento de diferenciar V. dahliae de V. tricorpus
(hongo no patógeno para el cultivo de girasol). También se cuenta con
iniciadores que amplifican únicamente secuencias de ADN de V.
dahliae y técnicas de PCR anidada y competitiva, que
permitirían cuantificar el ADN de V. dahliae en el
suelo, aún a bajas concentraciones. OBJETIVO
Desarrollar un método de detección y
cuantificación de V. dahliae para los suelos del sudeste
bonaerense mediante la amplificación de su ADN. |
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MATERIALES Y MÉTODOS
- Reacciones PCR con iniciadores generales
para el género Verticillium sp. y específicos para
V. dahliae sobre el ADN de cepas locales de V.
dahliae, y concentraciones variables de los iniciadores
ensayados.
- Reacciones PCR con iniciadores generales y
específicos sobre ADN de otros hongos comúnmente presentes en el
suelo.
- Extracción de ADN total desde suelo
adaptando protocolos citados en la bibliografía.
- Reacciones PCR anidadas (Primera PCR con
iniciadores generales + Segunda PCR con iniciadores específicos)
sobre ADN extraído de suelo.
- Evaluaciones de aproximación al uso de PCR
anidada cuantitativa ante variaciones en la cantidad de molde de ADN
de V. Dahliae.
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Figura 1. Click para ampliar
Figura 2. Click para ampliar |
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RESULTADOS
- Los iniciadores utilizados (en
concentración 10 µM ó 1 µM) amplificaron secuencias de ADN de
cepas locales de V. dahliae (Figura 1).
- Estos iniciadores no amplificaron el ADN
de otros hongos comúnmente presentes en el suelo.
- Se optimizó la extracción ADN total desde
suelo, realizando una suspensión del mismo en solución de leche
descremada y centrifugando antes del uso del tampón de extracción.
- Se obtuvo la amplificación esperada al
realizar reacciones de PCR anidada sobre ADN extraído de suelo aún
disminuyendo la cantidad de molde utilizado (de 5 µl a 1 µl).
- PCR anidada sobre distintas cantidades de
molde permitieron indagar respecto de la sensibilidad de la técnica
para su uso cuantitativo sobre ADN extraído de suelo (dilución hasta
1/5000 del molde de ADN en la primera PCR y hasta 1/1.000.000 del
producto de esta primera PCR usado en la segunda PCR). (Figura 2).
CONCLUSIONES
- V. dahliae puede ser
detectado en suelo con una metodología rápida y confiable.
- Restan aún ajustes metodológicos para la
cuantificación del inóculo presente.
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BIBLIOGRAFÍA
Volossiouk, E. , Robb, J. and Nazar, R.N. 1995.
Direct DNA extraction for PCR-mediated assays of soil organisms. Appl.
Environ. Microbiol.61(11): 3972-3976. |
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31 de Mayo al 1o de Junio
Hotel Hilton - Buenos Aires |
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Financiamiento: ASAGIR - PICT
08-09726 |
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