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Agosto/2001
En
el año 1999 fue presentado a la Agencia Nacional de Investigaciones un proyecto para
poner en marcha la metodología de clonado que tenía como fin disponer de la misma para
sus múltiples usos posteriores en biomedicina.
Este
proyecto fue aprobado y el inicio de actividades en el mismo tuvo lugar durante el año
2000 en simultaneidad con un proyecto FONTAR financiado por el BID gracias al cual en los
dos años previos se pudo adecuar la estructura de laboratorios y de equipamiento
necesarios para gran parte de los trabajos de la puesta en marcha de esta biotecnología.
Como
producto de lo anterior, durante los meses de septiembre a diciembre del año 2000 se
llevaron a cabo trabajos de investigación que tuvieron como objetivos la puesta a punto
de la metodología del clonado bovino en el Laboratorio de Biotecnología de la
Reproducción de la Estación Experimental del INTA de Balcarce y la realización de
investigaciones puntuales dirigidas a mejorar la eficiencia de la técnica.
Participaron
en esta etapa del proyecto los investigadores del Grupo de Biotecnología de la
Reproducción, Dres. Ricardo Alberio (Responsable del Grupo), Gustavo Palma, Juan Aller y
Germán Kaiser, todos investigadores del INTA y dos investigadores del Departamento de
Biología Molecular de la Universidad de Munich, Dres. Valeri Zakhartchenko y Ramiro
Alberio.
Los
trabajos consistieron en la producción de embriones clones producidos a partir de
células somáticas de animales adultos o de fetos. Brevemente, la metodología utilizada
fue la siguiente:
- Las células del individuo a clonar fueron cultivadas, multiplicadas y
preparadas para su uso posterior.
- Se obtuvieron ovarios de un matadero próximo a la estación
experimental. Estos ovarios fueron lavados y de ellos se obtuvieron los óvulos (ovocitos)
que se encontraban en los folículos.
- Los óvulos fueron madurados durante un período de 16 hs momento en el
cual se procedió a extraer sus núcleos por medio de una micropipeta.
- Inmediatamente después, con la misma micropipeta fue colocada la célula
a clonar en contacto con la pared del óvulo sin núcleo.
- Los conjuntos de óvulos y células a clonar se colocaron en una máquina
llamada fusor celular la cual mediante pulsos eléctricos produce la fusión de la pared
celular del óvulo con la de la célula a clonar ingresando el nuevo núcleo al óvulo y
quedando constituido el embrión.
- A continuación, se activó químicamente a este embrión para que diese
comienzo a sus divisiones. Cuando producto de estas divisiones llegó al estadio de
blastocisto (aproximadamente con 160 células) 7 días después de la fusión, el embrión
estuvo en el momento apropiado para ser colocado en el útero de una vaca llamada
receptora.
Durante
los dos meses de trabajo destinados a esta etapa del proyecto, se trabajó con células
somáticas de diferentes individuos y con diferentes características de interés tanto
zootécnico como biomédico. En las trece sesiones de clonado que se llevaron a cabo
durante ese período, se pusieron a fusionar un total de 819 óvulos con células
somáticas. El éxito de la fusión fue muy alto puesto que se observó un 91.7% de
fusiones. La etapa siguiente en la evaluación del proceso, fue la de óvulos fusionados
que comenzaron la división. Es así que se observó que el 54% de estos óvulos eran
embriones que habían comenzado la división celular entre las 24 y 36 hs después de ser
activados. Posteriormente, estos embriones de dos células debían seguir creciendo
durante 6 días para llegar al estadio en que podían ser transferidos a las vacas
receptoras. En esta etapa es en general donde se producen las mayores pérdidas ya que es
muy difícil de mantener en el laboratorio condiciones de cultivo similares a las que se
observan en el útero del animal vivo. A pesar de ello, a los 7 días después de la
fusión se observó que un 41% de los embriones que habían comenzado la división
alcanzaban el estadio deseado (llamados mórula y blastocisto) lo cual significa que un
22% de los óvulos fusionados habían llegado a ser embriones susceptibles de ser
transferidos a las vacas receptoras. Esta performance general puede ser considerada
excelente ya que fue similar a la obtenida en otros laboratorios del mundo que trabajan en
la misma técnica desde hace varios años.
La
última etapa, la transferencia a las vacas receptoras, resultó la que presentó algunos
inconvenientes. Puesto que los embriones producidos por esta técnica son de una
fragilidad superior a los obtenidos naturalmente, las exigencias para las receptoras de
los mismos también son mayores que de costumbre. En esta etapa no se había considerado
en principio la transferencia de los embriones producidos ya que no se sabía si la
técnica iba a dar los resultados que finalmente dio. Como consecuencia de ello, la
previsión de vacas receptoras de los embriones fue mucho menor que la de embriones
producidos. En consecuencia se debió recurrir a animales que tal vez no hubiesen sido
utilizados normalmente. De esta manera, se utilizaron 20 vaquillonas Aberdeen Angus de 22
meses, 25 vacas Aberdeen Angus adultas y 30 vaquillonas Aberdeen Angus x Hereford de 18
meses. En los dos primeros casos, los animales estuvieron en dos campos del INTA Balcarce
y en el último, en el campo de un productor vecino a la Estación Experimental
(Establecimiento El Regreso de Juan Ercolano). A lo largo de los dos meses de trabajo se
realizaron sucesivos tratamientos de sincronización de los celos en estos grupos de
animales de manera que estuviesen en el momento fisiológico apropiado para ser
transferidos cuando los embriones estuviesen disponibles. Los embriones fueron
transferidos por vía no quirúrgica dos veces por semana a los animales seleccionados.
A
los 45 días de realizadas las transferencias de los embriones se llevó a cabo un
diagnóstico de gestación por medio de ultrasonografía determinándose que del grupo de
las vacas transferidas había 3 con una gestación normal y una de ellas que aparentaba
tener mellizos. La fragilidad de las gestaciones con embriones clonados impidió que se
hiciera en este último caso un examen más detallado para confirmar si la gestación era
doble o simple.
A
los cuatro meses se repitió el examen y se observó que dos de las tres vacas habían
tenido un aborto espontáneo. La última de las vacas gestantes se encontraba en el campo
vecino del INTA y tenía una fecha estimada de parición entre el 15 y 20 de agosto del
2001. Debido a que esta se trataba de una vaquillona joven y que podía tener mellizos se
decidió adelantar el momento del nacimiento para evitar un accidente durante el parto.
Por ello se había previsto realizar una cesárea el día 28 de julio, es decir unos 15
días antes de la fecha de nacimiento prevista.
El
día 16 de julio se nos informó que la vaca había aparecido muerta dos días antes (14
de julio) por la mañana sin ningún síntoma previo que anunciara que esto podía
ocurrir. Cuando se hizo la necropsia del animal, se pudieron extraer dos fetos que eran,
como se esperaba, dos hembras Holando Argentino, clones de la vaca Holando Argentino del
INTA de la cual habían sido extraídas las células con que produjeron los embriones.
Debido a que la muerte se había producido dos días antes fue imposible determinar la
causa de la misma. En cuanto a las dos terneras, se observó que se encontraban muy
próximas de término, es decir que su nacimiento se debía producir en no más de 20
días. Una de ellas era completamente normal y con un peso de 25 kg y la otra presentaba
diferentes anomalías esqueléticas, particularmente en la cabeza y los miembros y una
importante cantidad de líquido en la cavidad abdominal. Por el estado de ambos fetos se
estimó que los dos estaban vivos al momento de la muerte de su madre.
En
síntesis, 15 días antes de la cesárea programada, la vaca conteniendo las dos terneras
clonadas murió junto con sus crías.
A
pesar que los resultados de este trabajo no fueron completamente satisfactorios, esta
experiencia en colaboración con la Universidad de Munich sirvió para poner a punto una
técnica de alta complejidad en nuestra Institución. La clonación de animales tiene gran
relevancia en la generación de animales modificados genéticamente para la producción de
proteínas de interés farmacéutico (factores de coagulación sanguínea), para la
industria (producción de proteína polimerizante, quimosina), para la generación de
modelos animales para el estudio de enfermedades humanas (fibrosis quística, esclerosis
múltiple, enfermedad de priones, etc.). Esta técnica está dando sus primeros pasos y
creemos que esta primera experiencia podrá ser definitivamente mejorada en el futuro
próximo.
Los
logros de este trabajo fueron múltiples y varios de los resultados obtenidos serán
presentados en el congreso Anual de la Asociación Argentina de Producción Animal (mes de
septiembre en Rafaela) y en el congreso Anual de la Sociedad Internacional de
Transferencia de Embriones (mes de enero del 2002, Foz de Iguazú, Brasil).
También,
la experiencia obtenida hasta el presente nos sirve en la actualidad para continuar con
los trabajos previstos en el proyecto y aumentar las probabilidades de poder contar con
terneros clonados a partir del año próximo.
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